Momentan testam produsele atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Am livrat, testat si oferit instructaj pentru cititorul UV Vis de la Accuris Instruments
Momentan testam produsele atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Am primit si testat un noul transiluminator UV LED de la Vision Med
Momentan testam produsele atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Suntem mandri sa devenim parteneri exclusivi Magbio Genomics in Romania
Competente de baza
Ca de obicei, mostre gratuite pentru aceste produse sunt disponibile.
Ne puteti solicita un esantion gratuit folosind formularul de contact.
Momentan testam produsele atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Species meat identification
with PCR - fun project
Furnizori testati :
INTRODUCERE
Figura 1 : Secvențele de nucleotide ale primerilor și regiunea țintă pe gena citocromului b. Casetele deschise indică primerul comun SIM și secvențele complementare ale primerului invers specific speciei. Punctele și casetele închise indică nucleotide identice și, respectiv, diferite cu secvențele de primer.
EXTRACTIA SI PREGATIREA PROBEI
REACTIA DE PCR
REZULTATE
Figura 2 : Linia 1 : Ladder 1kb plus NEB; Linia 2 : Control pozitiv - piept de pui fiert; Linia 3 : Ladder 1 kb Plus NEB; Linia 4 : Amestec - carnat de vita + porc + piept de pui fiert. Benzile sunt specifice pentru pui (227 pb), vita (274 pb) si porc (398 pb) ; Linia 5 : Amestec - carnat de porc + piept de pui fiert ; Linia 6 : Ladder 1 kb plus NEB; Linia 7 : Amestec - mic de proc, vita, oaie + piept de pui fiert. Cele 4 benzi sunt specifice pentru pui (227 pb), vita (274 pb), oaie (331 pb) si porc (398 pb). ; Linia 8 : Ladder 1 kb plus NEB
DISCUTII
Download protocol si specificatii HS Taq MM 2x (highQu)
Download protocol si specificatii Ala Genotyping Buffers
Testare noul stain pentru acizi nucleici
StainIN™ eco-RED
Furnizori testati :
Am dorit sa testam noul stain pentru acizi nucleici StainIn Eco Red (HighQu, Kraichtal, Germany), varianta mai safe si mai sensibila decat bromura de etidiu in lumina UV.
Mai jos (Figura 1) un gel de agaroza 1% migrat in TAE 1X gel si comparație între Eco Red și EtBr (filtru UV). In stângă avem gelul colorat cu EtBr (5 µl de EtBr in 50 ml gel topit), in dreapta gelul colorat cu Eco-Red (5 µl de EcoRed in 50 ml gel topit). 1,2,3 sunt plasmide izolate cu propria noastră trusă bazata pe tehnologie paramagnetica. 3 µl de produs de extractie au fost încărcați in fiecare godeu. Ladder-ul folosit (marker-ul de greutate) este 1 KbPlus de la (New England Biolabs, MA, USA). Gelurile au fost migrate in condiții identice. Aceleași probe încărcate, aceeași migrare efectuată, aceeași tensiune de migrare etc..
Figura 1 : Gel de agaroza 1% : Stanga, coloratie cu EtBR, dreapta, coloratie cu StainIn Eco Red. Aceeasi migrare. Probele 1,2,3 sunt identice pentru ambele geluri.
Practic, gelul a fost taiat in 2 bucati (s-a turnat mai întâi gelul colorat cu EtBr), apoi gelul a fost tăiat în jumătate, după care a fost adăugat gelul colorat cu EcoRed topit, langa cel intarit in prealabil. Puteti observa linia de taiere in Figura 2. În stânga gelul colorat cu EtBr, aceeași probă, 1=1, 2=2, 3=3, 10 µl lichid încărcat din fiecare. Migrarea a fost comuna pentru cele doua geluri.
Figura 2 : Gelul din Figura 1, filtru B&W. Puteți observa linia de tăiere a celor doua geluri.
Concluzie : Nu putem fi decat multumiti cu rezultatele obtinute. Am recomanda cu incredere noul stain de la furnizorul nostru, dupa cum se poate observa si pe gel,din punctul nostru de vedere, StainIn Eco este intr-adevar mai sensibil decat bromura de etidiu.
Ca de obicei, mostre gratuite pentru aceste produse sunt disponibile.
Ne puteti solicita un esantion gratuit folosind formularul de contact.
Momentan testam produsele atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Download protocol si specificatii StainIN™ eco-RED
Download raport de siguranta StainIN™ eco-RED
Constructia de vectori epizomali pentru expresie mamaliana
Furnizori folositi :
Introducere
Fie ca vorbim despre terapie genică virală sau non-virală, pasii cheie în aceasta sunt livrarea eficientă a genei către țesutul / celulele țintă, expresia sustinuta a genei in celulele/tesuturile de interes si transportul proteinei/enzimei sintetizate in tesuturile dorite pentru reactia in care enzima este utilizata, totul realizat intr-o maniera cat mai sigura.
Vectorii virali, desi mai eficienti in livrarea unei genei catre tesuturi, prezintă anumite probleme care implică integrarea vectorului in genom, incapacitatea de a fi administrati în mod repetat precum si posibila lor respingere de organismal gazdei. (Bulcha și colab. 2021).
Vectorii non-virali sunt mai siguri, au un cost redus comparativ cu echivalentul lor viral, sunt mai reproductibili și nu prezintă limită de dimensiune a ADN-ului. (Gaspar și colab. 2015).
Totusi, vectorilor de expresie non-virala le lipsește eficienta livrarii exogenei comparativa cu vectorii virali, desi au fost realizate progrese semnificative in ultima perioada prin adaugarea, modificarea si deleția anumitor componente in vectorii non-virali:
- Variante de tip SMARS reduse ca dimensiuni (Wang si colab. 2019)
- Eliminarea completa din vectori a secventelor de origine de replicare bacteriana si a genei de rezistenta la antibiotice folosite pentru replicarea si constructia vectorilor in bacterii prin constructia de minicercuri (Huang si colab. 2009; Gaspar și colab.2015) pentru a elimina sau incetini silențierea vectorului in vivo.
- eliminarea secventei genei de rezistentă la antibiotice pentru a imbunatati siguranța livrarii exogenei in vivo prin vectori ce utilizeaza metode de selectie alternative, cum ar fi sistemul RNA-out (Luke si colab. 2009).
- sau utilizarea vectorilor de tip nano-S/MAR, unde originea de replicare bacteriană de tip oriC utilizata uzual este inlocuita cu originea de replicare R6K (Bozza și colab. 2020) pentru a reduce silențierea sau pentru obtinerea unui construct de dimensiuni mai mici (Ribeiro și colab. 2012).
Ne-am propus constructia si optimizarea diferitelor constructe de tip S/Mars, epizomal, indeosebi in ceea ce priveste regiunile reglatoare : promotor, secventa de poliadenilare, secvente S/MAR, secvente de targhetare nucleara, peptide semnal etc.
Materiale si metode
Metoda de constructie a fost descrisa mai pe larg intr-un alt articol (Cepleanu și colab. 2023).
Pe scurt, pentru constructia vectorilor a fost folosita o varianta modificata a metodei Golden Gate, bazata pe capacitatea enzimelor de tip IIS de a taia în afara site-ului lor de recunoaștere, permițând ca două fragmente de ADN flancate de situsuri de restricție compatibile să fie digerate și ligate. Deoarece produsul legat de interes nu conține situsul de recunoaștere IIS original, nu este supus redigestiei într-o reacție de restricție-ligare. Toate produsele care contin secventa initiala de recunoastere vor fi redigerate, permițând componentelor lor să fie disponibile pentru legarea ulterioară, ceea ce duce la formarea unor cantități tot mai mari de produs dorit cu creșterea timpului și a ciclurilor de incubare. Deoarece poate fi aleasă orice secvență de patru nucleotide de capete coezive (sticky-ends) de la capetele fragmentelor digerate, mai multe fragmente de ADN compatibile pot fi asamblate într-o ordine definită într-o singură etapă de restricție-ligare.
Vectorii construiti constau din 6 fragmente fiecare, fragmente amplificate folosind primeri sintetizati de Synbio Technologies (New Jersey, USA). Amplificarea a fost efectuata folosind ALLin High Fidelity Mastermix, 2x (HighQu, Kraichtal, Germany). Au fost amplificate in total 3 regiuni promotor (Ef1A, CMV promoter + Enhancer, Chicken Beta Actin Promoter + CMV Enhancer), 2 gene (variante de transcript) ce codifica pentru glucocerebrozidaza (β–glucozidaza acida, glicozilceramidaza), enzima deficitara in Maladia Gaucher, un fragment (MARS - modular scaffold/matrix attachment region (S/MAR)), un fragment DTS40 (DNA nuclear targeting sequence 40), o regiune de poliadenilare (bovine growth hormone (BGH) poly-A sequence) si in final o regiune de replicare in celule bacteriene , Amp_Ori, ce conține gena de rezistenta la antibiotice (Ampicilina) si originea de replicare din vectorul pUC18 (derivat pMB1).
Din cauza naturii promotorului CAG, regiune greu de amplificat cu un continut CG ce ajunge si pana la 98%, pentru amplificare a fost folosit ALLin HotStart Taq Mastermix, 2x (HighQu, Kraichtal, Germany), amplificare reusita de la prima incercare. Amplificarea nu a fost repetata folosind o enzima High Fidelity.
In total au fost construite 6 variante de vectori epizomali folosind diferite combinatii de regiuni reglatoare : CMV_GBA1_BGH, CMV_GBA2_BGH, EF1A_GBA1_BGH, EF1A_GBA2_BGH, CAG_GBA1_BGH si CAG_GBA2_BGH. Ulterior, variantele for fi comparate pentru a evalua expresia proteinelor in celule mamaliene, capacitatea de retentie ca epizom, expresia evaluata prin RT-Q-PCR etc.
Inaintea introducerii fragmentelor in reactiile de ligare, fragmentele au fost curatate folosind HighPrep PCR magnetic beads (cat. AC-60005, MagBio Genomics, Gaithersburg, MD) impreuna cu Ala Magnetic Rack (96 positions) (Ala Biolab, București, România) in tuburi PCR de 0,2 ml. 5 µl din fiecare amplicon (fragment) au fost prelevati in tuburile pentru fiecare vector construit rezultand un volum final de curatat de 30 µl (pentru fiecare plasmida) (Figura 1). 10 µl din fiecare fragment PCR au fost ulterior incarcati in gel pentru a confirma prezenta fragmentelor de interes (Figura 2).
Dupa curatare, fragmentele din tuburile respective fiecarei plasmide au fost supuse digestiei si ligarii enzimatice. Ciclul de reactie a fost : (1 minut la 37 grade C + 1 minut la 16 grade C) X 30 cicluri, urmat de un ciclu de inactivare al enzimelor (5 minute la 60 grade Celsius) (vezi Figura 3 pentru detalii). Dupa ciclul de digestie ligare, peste fragmentele ligate a fost adaugat 2 µl de enzima DpnI pentru a inlatura orice fragmente ramase in urma reactiilor initiale din PCR (enzima sensibila la metilare). Pentru ligare digestie s-a utiilizat BsaI-HF®v2, T4 Dna Ligase si DpnI (New England Biolabs, MA, USA).
Reactia a fost urmatoarea : 20 µl fragmente curatate, 2,5 µl T4 DNA Ligase Buffer, 1,5 µl T4 DNA Ligase si 1 µl de BsaI-HF®v2. pentru fiecare tub folosit ce corespunde fiecarui tip de vector.
Figura 1 : 5 µl din fiecare amplicon (fragment) au fost prelevați in tubul pentru fiecare vector construit rezultand un volum final de curatat de 30 µl (pentru fiecare plasmida). Dupa reactia de ligare vor rezulta 6 plasmide diferite prin regiunile lor reglatoare (secventa promotor) si prin exogena exprimata (GBA1 vs GBA2) : CMV_GBA1_BGH, CMV_GBA2_BGH, EF1A_GBA1_BGH, EF1A_GBA2_BGH, CAG_GBA1_BGH si CAG_GBA2_BGH
Figura 2 : Fragmentele pentru EF1A_GBA1_BGH, EF1A_GBA2_BGH migrate in gel de agaroza 1%, Agarose, low EEO, GlenBiol™ (Glentham Life Sciences). Linia 1 - fragmentele pentru asamblarea EF1A_GBA1_BGH : DTS40 (aprox. 200 pb), secventa de poliadenilare Bovine Growth Hormone (aprox. 300 pb), MARS5 (aprox. 650 pb), promotorul Ef1A (aprox. 1260 pb), GBA1 (aprox. 1600 pb) si Amp_ori (aprox. 1800 pb). Similar, linia 2 - fragmentele pentru asamblarea EF1A_GBA2_BGH : DTS40 (aprox. 200 pb), secventa de poliadenilare Bovine Growth Hormone (aprox. 300 pb), MARS5 (aprox. 650 pb), promotorul Ef1A (aprox. 1260 pb), GBA2 (aprox. 1550 pb) si Amp_ori (aprox. 1800 pb).
Figura 3 : Schema de lucru pentru amplificare si asamblare vectori construiti. CDS = coding sequence, Promo = promotor (EF1A, CAG sau CMV), Terminator (secventa de poliadenilare).
Rezultate
Dupa reactia de ligare fragmentele rezultate au fost migrate similar cu procedura descrisa in Materiale si Metode. 10 µl din fiecare tub a fost incarcat in gel pentru a evalua reactia post ligare si post digestie DpnI in vederea transformarii. Figura 4 reprezinta fragmentele pre si post asamblare. Gelul a reprezentat un pas intermediar de control in reactie. In gelul A sunt prezentate fragmentele pre asamblare si in gelul B fragmentele post-asamblare. Se observa disparitia din gelul de agaroza a fragmentului de aprox. 3000 pb ce reprezinta digestia cu succes a ADN-ului metilat ramas in urma reactiilor de PCR (template-ul original utilizat). De asemenea, se observa disparitia unor fragmente (E.G fragmentul de 200 pb) si inglobarea lor in plasmida complet asamblata (Fragmentele nou aparute la aprox. 4000 pb si 5000 pb).
Figura 4 : Gel 1 : Fragmente pre-asamblare (EF1A_GBA1_BGH , linia 1, EF1A_GBA2_BGH , linia 2 si Neb 1 kb Plus Ladder, Linia 3). Fragmentele din partea superioara (A) reprezinta fragmente de ADN plasmidial ramase din reactia initiala de PCR, ulterior digerate cu DpnI : gelul numarul 2 (Linia 1 EF1A_GBA1_BGH post-asamblare, Linia 2 EF1A_GBA2_BGH post asamblare si linia 3, Neb 1 kb Plus Ladder). Fragmentele din partea superioara (Gelul numarul 2) : fragmente rezultate din reactia de asamblare.
Dupa reactia de asamblare, produsii reactiei vor fi transformati in E.coli NEB Turbo (New England Biolabs, MA, USA).
Ulterior, screening-ul pentru transformanti se va efectua prin digestie enzimatica dupa izolarea ADN-ului plasmidial din coloniile rezultate si prin PCR pentru fragmentele specifice fiecarui vector (E.G MARS5, GBA1, GBA2, CAG, EF1A etc).
Bibliografie
- Bulcha JT, Wang Y, Ma H, Phillip W.L. Thai, Guangping Gao(2021) Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther 6:1–24. 12 https://doi.org/10.1038/s41392-021-00487-6
- Gaspar V, de Melo-Diogo D, Costa E, Moreira A, Queiroz J, Pichon C, Correia I, Sousa F (2015) Minicircle DNA vectors for gene therapy: advances and applications. Expert Opin Biol Ther 15:353–379. https://doi.org/10.1517/14712598.2015.996544
- Wang D, Tai PWL, Gao G (2019) Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov 18:358–378. https://doi.org/10.1038/s41573-019- 0012-9
- Luke J, Carnes AE, Hodgson CP, Williams JA (2009) Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine 27:6454– 6459. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.06.017
- Matthias Bozza, Edward W. Green, Elisa Espinet, Alice De Roia, Corinna Klein, Vanessa Vogel, Rienk Offringa, James A. Williams, Martin Sprick, Richard P. Harbottle (2020) Novel non-integrating DNA Nano-S/MAR Vectors restore gene function in isogenic patient-derived pancreatic tumor models. Mol Ther - Methods Clin Dev 17:957– 968. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.04.017
- Ribeiro S, Mairhofer J, Madeira C, Diogo MM, Lobato da Silva C, Monteiro G, Grabherr R, Cabral JM (2012) Plasmid DNA Size Does Affect Nonviral Gene Delivery Efficiency in Stem Cells. In: https://home.liebertpub.com/cell. https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/cell.2011.0093.
- Cepleanu-Pascu IA, Stan M, Cocioba S, Stoica I. Easy method for six-fragment Golden Gate Assembly of modular vectors. Biotechniques. 2023 Feb;74(2):85-99. doi: 10.2144/btn-2022-0041. Epub 2023 Jan 24. PMID: 36691899.
Am folosit High Prep de la Magbio Genomics pentru PCR clean-up si size selection
Furnizori testati :
Purificarea si extractia produselor PCR din gel este un proces nu intotdeauna fiabil. Indiferent de furnizorul kit-ului, din experienta noastra, yield-ul pentru curatarea si extractia din gel este redus.
Ca si alternativa, prezentam "size selection" si PCR clean-up folosind bilute magnetice. Am utilizat HighPrep PCR magnetic beads (cat. AC-60005, MagBio Genomics, Gaithersburg, MD).
In video am efectuat purificare si curatare pentru un fragment amplificat in prealabil dintr-o plasmida. Fragmentul este promotorul mamalian EF‐1α.
Deoarece am avut amplificare non-specifica, am ales sa nu optimizam reactia prin gradient.
Solutia mai simpla a fost de a curata si izola fragmentul de dimensiunea dorita (aprox. 1200 pb) (Figura 2). Fragmentul va fi folosit in clonare pentru experimente ulterioare. In Figura 1 puteti observa alt fragment amplificat. Similar, am folosit bilutele magnetice MagBio pentru a selecta marimea dorita.
Figura 1 : GBA1 glucosylceramidase beta 1 [ Homo sapiens (human) ], transcript variant 1, amplificat prin PCR. Inainte si dupa curatare.
Figura 2 : Promotorul EF‐1α amplificat, prin PCR. Inainte si dupa curatare.
Am masurat, de asemenea, și yield-ul (cantitatea de ADN pur rezultata). Pentru aceasta, o porțiune din gena MTHFR (198 pb) a fost amplificată folosind ALLin HotStart Taq Mastermix, 2x (HighQu, Kraichtal, Germany), (Figura 3) Extracția a fost efectuată folosind kit-ul propriu Ala Genotyping Buffers (Ala Biolab, București, România) din swab bucal. Toți primerii folosiți în experimente au fost sintetizati de Synbio Technologies (New Jersey, USA). Experimentele de amplificare a genei MTHFR au fost efectuate pentru unul dintre clienții noștri. Produsul PCR (40 µl) a fost curățat folosind HighPrep PCR magnetic beads (cat. AC-60005, MagBio Genomics, Gaithersburg, MD) și eluat într-un volum final de 40 µl de apa PCR. Pentru cuantificare am folosit Qubit Fluorometric Quantification (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). După o diluție de 1:10 a produsului final pur (ampliconul PCR rezultat din reacția de curățare cu particule magnetice) concentrația de ADN pur a fost de 57,9 ng / µl (nediluat 579 ng / µl) (Figura 4) (triplicat)
Figura 3 : MTHFR (Regiunea C667T) [ Homo sapiens (human) ], amplificată prin PCR
Figura 4 : Rezultat după diluție 1 : 10. Concentrație de ADN / µl. Volum final 40 µl.
Mostre gratuite pentru acest kit sunt disponibile.
De asemenea, la fiecare doua kit-uri de separare magnetica, Bioclone sau Magbio Genomics achizitionate de la noi veti primi gratuit un rack magnetic cu 8 pozitii pentru tuburi de 1,5 / 2 ml, ref. ALAR158. Rack-ul poate fi folosit si cu tuburi de 0,5 ml, precum am demonstrat si in video.
Momentan testam produsul atat pentru proiectele noastre cat si pentru a veni in ajutorul dumneavoastra cu suportul necesar.
Magnetic rack for bead separation Ref. ALAR158
Classification Magnetic bead separation rack
Ref ALAR158
Description Magnetic bead separation racks for 8 1,5 ml tubes.
Certification CE, ISO
Color Clear
Capacity Double holes, 4*2 holes
Magnet N42 Neodymium(NdFeB) Magnet
Rack material Acrylic
Application Nucleic acid sample purification
and separation
STUDII ASUPRA FUNGILOR CU CALITATI DE MICOPARAZITISM IDENTIFICATI PE SUPRAFETELE DE LEMN ALE UNOR BISERICI DE PATRIMONIU DIN JUD. HUNEDOARA
ALINA SÎRGHI1, 2, ADRIAN PASCU1, 2, IRINA GHEORGHE1, 2
1Universitatea din București, Facultatea de Biologie, Splaiul Independentei 91-95, București, 050095 2Institutul de Cercetare al Universității din București (ICUB), B.P.Hașdeu, Nr.7, București 050095
STUDII ASUPRA FUNGILOR CU CALITATI DE MICOPARAZITISM IDENTIFICATI PE SUPRAFETELE DE LEMN ALE UNOR BISERICI DE PATRIMONIU DIN JUD. HUNEDOARA
ALINA SÎRGHI1, 2, ADRIAN PASCU1, 2, IRINA GHEORGHE1, 2
1Universitatea din București, Facultatea de Biologie, Splaiul Independentei 91-95, București, 050095 2Institutul de Cercetare al Universității din București (ICUB), B.P.Hașdeu, Nr.7, București 050095
Mentiune kit Ala Genotyping Buffers (ABIGS).
Promotie Laddere ADN Maestrogen
Pana la sfarsitul anului puteti beneficia de promotia pentru Laddere ADN de la Maestrogen (Taiwan).
In dreapta, imagine cu Ladder Maestrogen Accuruler 1kb Plus (5 µl) migrat in gel de Agaroza 1% (TAE 1X).
Promotia este valabila pana la sfarsitul anului la toate tipurile de ladder ADN (100 bp, 100 bp plus si 1 Kb plus).
Pret promotional pentru 150 incarcari in gel (5 µl) 195 lei fara TVA.
MN-917 MaestroNano DNA RNA Protein Quantification Spectrophotometer
Tocmai ce am primit un spectrofotometru pentru microvolume de la producatorul Maestrogen. Spectrofotometrul se va duce la unul dintre clienții noștri.
Le mulțumim foarte mult pentru încredere și ii asiguram de suportul nostru continuu.
P.S Un mic preview/ review : https://www.youtube.com/watch?v=LYqOxosqsPE&t=315s
Devenim distribuitori oficiali highQu
HighQU este un furnizor german pentru reactivi de biologie moleculara.
Ei ofera o gama larga de produse inclusiv kit-uri de LAMP, polimeraze, master mix-uri, DNA si protein ladders si multe altele.
Fir ca este vorba de MM pentru RT-qPCR sau end-point PCR garantam calitatea produselor HighQU.
Incercati o mostra gratuita.
Am testat in house si am fost impresionati de robustetea mastermix-urilor AllIn Hotstart Master Mix. De asemenea, am testat si putem recomanda mastermix-urile High Fidelity, Ladder-ele ADN, ladder-ele proteice, loading dye-urile si gel stain-urile.
Obtineti gratuit o mostra pentru a va convinge de calitatea produselor.
Devenim distribuitori Benchmark Scientific si Accuris Instruments
Furnizori de echipamente de laborator de calitate superioara
Atat Benchmark cat si spin-off-ul din compania mama, Accuris Intruments, furnizeaza echipamente de inalta calitate pentru laborator. De la centrifugi, vortexuri, incubatoare cu sau fara agitare, echipamente PCR, ELISA, extractie de ADN/ARN/Proteine, Balante analitice si de precizie, fiti siguri ca va veti bucura mult timp de acum incolo de echipementele lor.
La fel, ne dorim o colaborare cat mai lunga cu aceste companii.
Furnizorii ii puteti gasi si pe Select Science (site dedicat review-urilor furnizorilor facute direct de catre cercetatori.
Cu un rating de 4.6 din 5 fiti siguri ca instrumentele va vor ajuta in toate proiectele dumneavoastra.
https://www.selectscience.net/suppliers/benchmark-scientific-inc/?compID=8287
Semnam contract de distributie cu Bioclone
Bioclone ... furnizor de beads-uri magnetice.
Bioclone a fost fondată de cercetatori pentru cercetatori. Compania este cunoscută pentru că furnizează în mod constant produse unice și de ultimă generatie pentru piețele de cercetare și de diagnosticare clinică. Bioclone este furnizorul preferat de margele magnetice și proteine recombinate din intreaga lume.
Ne dorim o colaborare cat mai lunga cu ei.
Au in portofoliu o multitudine de produse ce variaza de la curatare si izolare de ADN, purificare proteica, bilute magnetice acoperite cu anticorpi si antigene etc.
Dezvoltare, testare si optimizare extractie din gel Ala Biolab
Astăzi optimizare și dezvoltare pentru Kit-ul de extracție ADN din gel Ala Gel Extraction kit.
Pentru optimizare am folosit plasmide pcDNA3.1(+) izolate în prealabil din E.coli cu Ala Prep (kit-ul de izolare plasmidiala dezvoltat de noi).
4µl din fiecare replicat au fost supuși digestiei cu NcoI pentru a genera un pattern de 3 fragmente (diferite mărimi) : 3342 pb, 1351 pb și 735 pb.
Fragmentele au fost ulterior extrase din gel de agaroza 1 % (1X TAE) și migrate pe alt gel de agaroza pentru vizualizare.
Au fost încercate mai multe Rețete de Wash Buffer.
Kit-ul necesita optimizari insa rezultatele preliminare sunt promițătoare.
De asemenea, au fost testate diferite tipuri de coloane. Următorul experiment ne va spune dacă ADN-ul rezultat din extracție este pretabil pentru aplicații downstream cum ar fi secvențierea și subclonarea (T4 ligaza).
O noua zi, un nou test pentru Ala Prep
De aceasta data cu o plasmid diferită...DsRED
Kit-ul Ala Prep a fost testat (tot în modul midi) versus un kit midiprep al unui furnizor foarte cunoscut.
1Z, 2Z, 3A, 4A rezultate Ala prep, 4 colonie diferite. dsRED Andrei kit-ul de referință (Midi prep).
Au fost folosite câte 50 ml cultura bacteriana. Testele au fost efectuate din aceeași tulpina, aceeași cultura de 100 ml..
Rezultatele vorbesc de la sine. Tulpina bacteriana...E.coli TOP10.
Testele complete (yield și plasmida folosita) vor fi disponibile pe site în format EXCEL.
Optimizare Ala Prep
Multumim clientilor care ne ajuta sa dezvoltam, optimizam si sa testam kit-urile noastre proprii. Pana acum rezultatele sunt extrem de promitatoare.
Din cate stim este primul kit de izolare plasmidiala dezvoltat, testat si optimizat in Romania.
Astazi testam kit-ul cu bacterii TOP10. Plasmida...SpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0, o plasmida de 9175 pb.
Deoarece kit-ul poate fi folosit in mai multe moduri de izolare plasmidiala incercam sa testam cat mai multe tulpini de E.coli si cat mai multe tipuri de plasmide (de la clasicul pUC18 cu Amp ca gena de rezistenta si high copy number origin of replication pana la plasmide mai speciale, toxice pentru celule (pCAS9) cu gena de selectie pentru Kan, 12000 pb lungime, origine de replicare sensibila la temperatura si low copy number).
Pana acum kit-ul a fost testat si optimizat cu urmatoarele tulpini bacteriene : E.coli NEB TURBO, E.Coli DH5Alpha, TOP 10. Plasmidele izolate variaza de la pUC18, pcDNA3.1(+), plasmide proprii si pCAS9.
De asemenea, incercam sa validam kit-ul si pentru transfectii de celule mamaliene. Pana acum modul MINI a fost testat cu succes in linii celulare precum HEPG2, HeLA, Hek293, Hek293T si CHO.
Standarde ARN si ADN
Standarde de ADN pentru unul dintre (speram) viitorii nostri parteneri.
Acesta este inceputul de drum.
S-a cerut sa lucram un PCR in anumite conditii foarte specifice pentru aplicatiile downstream pe care le va efectua pentru cercetare.
Am sugerat sa construim si cateva standarde. Cu ADN de concentratie cunoscuta, cu o lungime prestabilita.
De abia asteptam sa vedem rezultatele finale si de asemenea speram ca ne vom ridica asteptarilor.
